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  • 细胞克隆形成实验


    一、 实验原理

    克隆形成实验是肿瘤细胞学研究中的一种常用技术,其原理是将细胞分离成单细胞悬液,在培养基上接种培养,根据集落形成数量和大小来检测细胞增殖能力和致瘤性。该实验可用来研究肿瘤细胞的增殖能力、侵袭性,探讨细胞对不同杀伤因素的敏感性。

    根据培养基是否需要软琼脂,克隆形成实验可以分为平板克隆形成实验(PCF)和软琼脂克隆形成实验(SACF)。PCF是直接将细胞接种于培养瓶、培养皿中,优点为操作简便、细胞间分泌的促生长因子可在培养液中扩散、克隆形成率高,适用于贴壁生长的细胞;缺点为细胞在 贴壁前易于移动。SACF是采用半固体培养基模拟体内生长环境,适用于悬浮细胞及不依赖于贴壁生长的肿瘤细胞。在悬浮状态下不能增殖的细胞(如正常成纤维细胞)不适用此法。

    软琼脂克隆形成实验主要用于非贴壁生长的细胞,某些细胞(如正常成纤维细胞)在悬浮状态下不能增殖,不适用于此法。某些恶性肿瘤细胞,不仅在贴壁状态下能增殖,在悬浮状态下能增殖,其在软琼脂中形成克隆的能力反映了恶性程度,这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。让细胞处于不贴壁以及单细胞状态,模拟体内细胞处于半固液态的情况,在此状态下检测细胞的增殖能力。单细胞处于soft agar中,就如胰酶消化后的状态,及圆形,此后细胞继续增殖、分裂,形成单克隆球形。半固体环境肯定是要求恶性程度高的容易生长,所以不会比平板克隆快,只要能够和对照比较即有意义。

    克隆形成试验是测定细胞增殖能力的有效方法之一,贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。细胞克隆形成率表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量,可以反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。


    二、应用简介

    软琼脂克隆形成实验可用于:

    ①细胞分化的基础研究;

    ②临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。

    当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆。

    平板细胞克隆适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞可用于:

    ①细胞增殖实验

    ②细胞群体依赖性检测


    三、实验方法



    四、样本送检要求


    五、案例展示

     

    DU145细胞克隆形成的图片(相机左,显微镜右)


    六、常见问题

    平板克隆实验

    1)平板克隆形成实验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。

    2)实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。

    3)细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度,否则结果的准确度会受到很大影响。

    4)一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。

    软琼脂培养克隆形成试验

    1)软琼脂克隆的操作相对复杂,在实验过程中一定要注意无菌操作。

    2)在将琼脂于培养基混匀时,要注意琼脂温度,而且动作要迅速,避免局部结块。

    3)制备好底层琼脂后,要待其完全凝固后再浇上上层琼脂。

    4)通常下层1.2% Argrose快些铺,略有不平是没有太大关系的,上层0.7% Argrose与细胞混合时水浴不大于40度,小心均匀的铺,37度不会那么快凝固,孵箱里过几天就好了。

    5)软琼脂克隆形成试验方法简单,适用于不贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大,接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞。

    6)软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系,正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验。 



    七、服务流程


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